Proteómica de enfermedades infecciosas (MaldiTof)
Introducción
El uso de la espectrometría de masas Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization-Time of Flight (MALDI-TOF) es una técnica implantada en los laboratorios de Microbiología Clínica que permite llevar a cabo la identificación de microorganismos.
La proteómica es una herramienta verdaderamente útil en el estudio de las enfermedades infecciosas, proporcionando una visión global. Los análisis proteómicos permiten la realización de un estudio básico de la enfermedad, facilitando la búsqueda de marcadores de infección o virulencia.
Posteriormente, los resultados obtenidos tienen una aplicabilidad traslacional dirigida al diagnóstico y pronóstico de la enfermedad, además de permitir el desarrollo de nuevas terapias antimicrobianas y el avance en vacunología.
Las técnicas proteómicas no solo permiten la identificación de nuevos marcadores, sino que pueden ser implantadas como técnicas de diagnóstico rápido, pudiendo dirigir el tratamiento con mayor celeridad evitando los cultivos in vitro, que requieren largos tiempos de incubación, retrasando el diagnóstico, además de generar falsos negativos en aquellos microorganismos viables pero no cultivables.
Actualmente, la proteómica es un área valorada por su clara utilidad, trabajo en el ámbito de las enfermedades infecciosas. Para mejorar su utilidad en el futuro, debemos concienciar a todo el personal implicado en el ámbito asistencial de su importancia, así como integrar los resultados de los estudios de todas las «ómicas».
Espectrometría de masas
La espectrometría de masas (MALDI-TOF) es una herramienta basada en espectrometría de masas que permite obtener en unos minutos la identificación de microorganismos tales como bacterias (incluyendo micobacterias), levaduras y hongos filamentosos.
La denominación «MALDI» proviene de Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization, y «TOF» alude al analizador de iones que se acopla al MALDI, que es del tipo de tiempo de vuelo (time of flight).
Para realizar el análisis mediante MALDI-TOF es necesario que las proteínas de los microorganismos se ionicen. Para ello, las colonias de microorganismos se depositan sobre la placa porta muestras, y a continuación sobre esa muestra se deposita una disolución matriz, la placa es introducida en la cámara de alto vacío, donde la superficie cristalina de la muestra es expuesta a disparos de un láser de longitud de onda en la zona ultravioleta del espectro, con lo que la matriz absorbe la energía del láser produciéndose la sublimación del analito y de la matriz.
Ya en fase gaseosa, la estabilización de la matriz tiene lugar mediante la liberación de protones que, en parte, son captados por las proteínas de las bacterias, generándose fragmentos de proteínas con carga positiva. Mediante un electrodo se genera un campo eléctrico que acelera los iones formados desde las proximidades de la muestra hacia el analizador de masas. De esta forma, la trayectoria lineal. Así, el tiempo que tardan los iones en recorrer el tubo es proporcional a la relación masa/carga (m/z) de los mismos. En última instancia está el detector de los iones previamente separados. Si la carga (z) es igual a uno, como es habitual en la ionización blanda de la técnica MALDITOF, el espectro de masas es la representación de la intensidad frente a la masa de los iones formados 54,55. El sistema MALDITOF realiza la identificación rápida de microorganismos mediante el método de la «huella peptídica». En este método, las proteínas del microorganismo a identificar son hidrolizadas en pequeños ˜ péptidos y se obtiene el correspondiente espectro de masas del hidrolizado, que se conoce con el nombre de huella peptídica. Esta huella, que es única para cada microorganismo, es comparada con las huellas de microorganismos conocidos presentes en la base de datos, de tal forma que la huella problema se puede asociar con la huella más semejante y obtener así la identificación del microorganismo.
Limitaciones en la Identificación de microorganismos con el IVD MALDI Biotyper
Limitaciones:
El IVD MALDI Biotyper puede identificar bacterias y levaduras con alta probabilidad siempre que sean cultivos puros en placas de agar (colonias únicas) y cuando sus patrones de referencia correspondientes se encuentren en la base de datos (la lista se suministra bajo solicitud). El IVD MALDI Biotyper no es adecuado para:
- La identificación de hongos filamentosos
- El análisis directo de muestras de pacientes, esto es sin preparar un subcultivo
- El análisis de cultivos mixtos
- La identificación de microorganismos de Clase de seguridad L ¾
- La identificación de microorganismos cuyo patrón de referencia no se encuentra en la base de datos
- La identificación de virus
- La identificación de serotipos
Para algunos microorganismos solo es posible identificar el género y no la especie. Esto es especialmente cierto para los aislados de Salmonella.
Conclusiones
La espectrometría de masas MALDI-TOF es un sistema rápido, fiable y potente para la identificación de agentes patógenos en minutos, facilitando instaurar el tratamiento antimicrobiano dirigido reduciendo en forma exponencial tiempo y costes.